本文目录WifiDog 认证原理和流程gateway是什么设备如何设计含attb位点的pcr引物掌握这些技术，基因克隆不是梦ip subnet 和ip address及gateway和mask他们分别代表什么之间有什么联系和区别rna水平修饰对基因表达影响ligation-independent cloning网络对克硬盘怎么克如何使用网络ghost的原理和运用WifiDog 认证原理和流程

WifiDOG 是一个热点系统，包含了认证服务器和客户端两部分组成，认证原理大体说下： General Flow Description: 一般流程描述： ①The client does his initial request, as if he was alrea

gateway是什么设备

网关 网关曾经是很容易理解的概念。在早期的因特网中，术语网关即指路由器。路由器是网络中超越本地网络的标记， 这个走向未知的“大门”曾经、现在仍然用于计算路由并把分组数据转发到源始网络之外的部分，因此， 它被认为是通向因特网的大门。随着时间的推移，路由器不再神奇，公共的基于IP的广域网的出现和成熟促进了路由器的成长。 现在路由功能也能由主机和交换集线器来行使，网关不再是神秘的概念。现在，路由器变成了多功能的网络设备， 它能将局域网分割成若干网段、互连私有广域网中相关的局域网以及将各广域网互连而形成了因特网， 这样路由器就失去了原有的网关概念。然而术语网关仍然沿用了下来，它不断地应用到多种不同的功能中， 定义网关已经不再是件容易的事。目前，主要有三种网关： 协议网关 应用网关 安全网关 唯一保留的通用意义是作为两个不同的域或系统间中介的网关，要克服的差异本质决定了需要的网关类型。 一、协议网关 协议网关通常在使用不同协议的网络区域间做协议转换。这一转换过程可以发生在OSI参考模型的第2层、第3层或2、3层之间。 但是有两种协议网关不提供转换的功能：安全网关和管道。由于两个互连的网络区域的逻辑差异， 安全网关是两个技术上相似的网络区域间的必要中介。如私有广域网和公有的因特网。这一特例在后续的“组合过滤网关”中讨论， 此部分中集中于实行物理的协议转换的协议网关。1、管道网关 管道是通过不兼容的网络区域传输数据的比较通用的技术。数据分组被封装在可以被传输网络识别的帧中，到达目的地时， 接收主机解开封装，把封装信息丢弃，这样分组就被恢复到了原先的格式。例如在下图中，IPv4数据由路由器A封装在IPv6分组中， 通过IPv6网络传递给一个IPv4主机，路由器解开IPv6的封装，把还原的IPv4数据传递给目的主机。 管道技术只能用于3层协议，从SNA到IPv6。虽然管道技术有能够克服特定网络拓扑限制的优点，它也有缺点。 管道的本质可以隐藏不该接受的分组，简单来说，管道可以通过封装来攻破防火墙，把本该过滤掉的数据传给私有的网络区域。 2、专用网关 很多的专用网关能够在传统的大型机系统和迅速发展的分布式处理系统间建立桥梁。 典型的专用网关用于把基于PC的客户端连到局域网边缘的转换器。该转换器通过X.25网络提供对大型机系统的访问。 下图演示了从PC客户端到网关的过程，网关将IP数据通过X.25广域网传送给大型机。 这些网关通常是需要安装在连接到局域网的计算机上的便宜、单功能的电路板，这使其价格很低且很容易升级。在上图的例子中， 该单功能的网关将大型机时代的硬连线的终端和终端服务器升级为PC机和局域网。 3、两层协议网关 两层协议网关提供局域网到局域网的转换，它们通常被称为翻译网桥而不是协议网关。 在使用不同帧类型或时钟频率的局域网间互连可能就需要这种转换。 (1)帧格式差异 IEEE802兼容的局域网共享公共的介质访问层，但是它们的帧结构和介质访问机制使它们不能直接互通。如下图： 翻译网桥利用了2层的共同点，如MAC地址，提供帧结构不同部分的动态翻译，使它们的互通成为了可能。 第一代局域网需要独立的设备来提供翻译网桥，如今的多协议交换集线器通常提供高带宽主干， 在不同帧类型间可作为翻译网桥，如下图所示：现在翻译网桥的幕后性质使这种协议转换变得模糊，独立的翻译设备不再需要， 多功能交换集线器天生就具有2层协议转换网关的功能。 替代使用仅涉及2层的设备如翻译网桥或多协议交换集线器的另一种选择是使用3层设备：路由器。 长期以来路由器就是局域网主干的重要组成部分，见下图。如果路由器用于互连局域网和广域网， 它们通常都支持标准的局域网接口，经过适当的配置，路由器很容易提供不同帧类型的翻译。 这种方案的缺点是如果使用3层设备路由器需要表查询，这是软件功能，而象交换机和集线器等2层设备的功能由硬件来实现， 从而可以运行得更快。 (2)传输率差异 很多过去的局域网技术已经提升了传输速率，例如，IEEE 802.3以太网现在有10Mbps、100Mbps和1bps的版本， 它们的帧结构是相同的， 主要的区别在于物理层以及介质访问机制，在各种区别中，传输速率是最明显的差异。令牌环网也提升了传输速率， 早期版本工作在4Mbps速率下，现在的版本速率为16Mbps，100Mbps的FDDI是直接从令牌环发展来的，通常用作令牌环网的主干。 这些仅有时钟频率不同的局域网技术需要一种机制在两个其它方面都兼容的局域网间提供缓冲的接口，现今的多协议、 高带宽的交换集线器提供了能够缓冲速率差异的健壮的背板，如下图： 如今的多协议局域网可以为同一局域网技术的不同速率版本提供内部速率缓冲，还可以为不同的802兼容的局域网提供2层帧转换。 路由器也可以做速率差异的缓冲工作，它们相对于交换集线器的长处是它们的内存是可扩展的。 其内存缓存进入和流出分组到一定程度以决定是否有相应的访问列表（过滤）要应用，以及决定下一跳， 该内存还可以用于缓存可能存在于各种网络拓扑间的速率差异，如下图：二、应用网关 应用网关是在使用不同数据格式间翻译数据的系统。典型的应用网关接收一种格式的输入，将之翻译， 然后以新的格式发送，如下图。输入和输出接口可以是分立的也可以使用同一网络连接。 一种应用可以有多种应用网关。如Email可以以多种格式实现，提供Email的服务器可能需要与各种格式的邮件服务器交互， 实现此功能唯一的方法是支持多个网关接口。下图所示为一个邮件服务器可以支持的几种网关接口。应用网关也可以用于将局域网客户机与外部数据源相连，这种网关为本地主机提供了与远程交互式应用的连接。 将应用的逻辑和执行代码置于局域网中客户端避免了低带宽、高延迟的广域网的缺点，这就使得客户端的响应时间更短。 应用网关将请求发送给相应的计算机，获取数据，如果需要就把数据格式转换成客户机所要求的格式，见下图所示。三、安全网关 安全网关是各种技术有趣的融合，具有重要且独特的保护作用，其范围从协议级过滤到十分复杂的应用级过滤。防火墙主要有三类： 分组过滤 电路网关 应用网关 注意：三种中只有一种是过滤器，其余都是网关。 这三种机制通常结合使用。过滤器是映射机制，可区分合法的和欺骗包。每种方法都有各自的能力和限制，要根据安全的需要仔细评价。1、包过滤器 包过滤是安全映射最基本的形式，路由软件可根据包的源地址、目的地址或端口号建立许可权， 对众所周知的端口号的过滤可以阻止或允许网际协议如FTP、rlogin等。过滤器可对进入和/或流出的数据操作， 在网络层实现过滤意味着路由器可以为所有应用提供安全映射功能。作为（逻辑意义上的）路由器的常驻部分， 这种过滤可在任何可路由的网络中自由使用，但不要把它误解为万能的，包过滤有很多弱点，但总比没有好。 包过滤很难做好，尤其当安全需求定义得不好且不细致的时候更是如此。这种过滤也很容易被攻破。包过滤比较每个数据包， 基于包头信息与路由器的访问列表的比较来做出通过/不通过的决定，这种技术存在许多潜在的弱点。首先， 它直接依赖路由器管理员正确地编制权限集，这种情况下，拼写的错误是致命的， 可以在防线中造成不需要任何特殊技术就可以攻破的漏洞。即使管理员准确地设计了权限，其逻辑也必须毫无破绽才行。 虽然设计路由似乎很简单，但开发和维护一长套复杂的权限也是很麻烦的， 必须根据防火墙的权限集理解和评估每天的变化，新添加的服务器如果没有明确地被保护，可能就会成为攻破点。 随着时间的推移，访问权限的查找会降低路由器的转发速度。每当路由器收到一个分组， 它必须识别该分组要到达目的地需经由的下一跳地址，这必将伴随着另一个很耗费CPU的工作： 检查访问列表以确定其是否被允许到达该目的地。访问列表越长，此过程要花的时间就越多。 包过滤的第二个缺陷是它认为包头信息是有效的，无法验证该包的源头。 头信息很容易被精通网络的人篡改， 这种篡改通常称为“欺骗”。 包过滤的种种弱点使它不足以保护你的网络资源，最好与其它更复杂的过滤机制联合使用，而不要单独使用。2、链路网关 链路级网关对于保护源自私有、安全的网络环境的请求是很理想的。这种网关拦截TCP请求，甚至某些UDP请求， 然后代表数据源来获取所请求的信息。该代理服务器接收对万维网上的信息的请求，并代表数据源完成请求，如下图。实际上， 此网关就象一条将源与目的连在一起的线，但使源避免了穿过不安全的网络区域所带来的风险。这种方式的请求代理简化了边缘网关的安全管理，如果做好了访问控制，除了代理服务器外所有出去的数据流都被阻塞。 理想情况下，此服务器有唯一的地址，不属于任何内部使用的网段。这绝对使无意中微妙地暴露给不安全区域的信息量最小化， 只有代理服务器的网络地址可被外部得到，而不是安全区域中每个联网的计算机的网络地址。 3、应用网关 应用网关是包过滤最极端的反面。包过滤实现的是对所有穿过网络层包过滤设备的数据的通用保护， 而应用网关在每个需要保护的主机上放置高度专用的应用软件，它防止了包过滤的陷阱，实现了每个主机的坚固的安全。 应用网关的一个例子是病毒扫描器，这种专用软件已经成了桌面计算的主要产品之一。它在启动时调入内存并驻留在后台， 持续地监视文件不受已知病毒的感染，甚至是系统文件的改变。 病毒扫描器被设计用于在危害可能产生前保护用户不受到病毒的潜在损害。 这种保护级别不可能在网络层实现，那将需要检查每个分组的内容，验证其来源，确定其正确的网络路径， 并确定其内容是有意义的还是欺骗性的。这一过程将产生无法负担的过载，严重影响网络性能。4、组合过滤网关 使用组合过滤方案的网关通过冗余、重叠的过滤器提供相当坚固的访问控制，可以包括包、链路和应用级的过滤机制。 这样的安全网关最普通的实现是象岗哨一样保护私有网段边缘的出入点，通常称为边缘网关或防火墙。 这一重要的责任通常需要多种过滤技术以提供足够的防卫。下图所示为由两个组件构成的安全网关：一个路由器和一个处理机。 结合在一起后，它们可以提供协议、链路和应用级保护。 这种专用的网关不象其它种类的网关一样，需要提供转换功能。作为网络边缘的网关，它们的责任是控制出入的数据流。 显然的，由这种网关联接的内网与外网都使用IP协议，因此不需要做协议转换，过滤是最重要的。 保护内网不被非授权的外部网络访问的原因是显然的。控制向外访问的原因就不那么明显了。在某些情况下， 是需要过滤发向外部的数据的。例如，用户基于浏览的增值业务可能产生大量的WAN流量，如果不加控制， 很容易影响网络运载其它应用的能力，因此有必要全部或部分地阻塞此类数据。 联网的主要协议IP是个开放的协议，它被设计用于实现网段间的通信。这既是其主要的力量所在，同时也是其最大的弱点。 为两个IP网提供互连在本质上创建了一个大的IP网， 保卫网络边缘的卫士--防火墙--的任务就是在合法的数据和欺骗性数据之间进行分辨。

如何设计含attb位点的pcr引物

使用Multisitegateway技术构建载体的方法 Multisite gateway 实验步骤如下 设计含有attB位点的PCR引物建议使用Vector NTI Advance 软件来设计含有attB和attBr的引物。 上游引物必须同时满足以下条件 含有2225 bp的attB位点 至少1825 bp的模板或插入片段特异性的序列 multisitegateway引物序列的特异性 Fig specificsequences Multisitegateway 下游引物的设计也需满足以上三个条件。 因为我们要在E coli 体内表达蛋白 所以设计上游引物时 要在attB位点之前加上SD Shine Dalgarno 序列来保证翻译的准确性。同时为了保证阅读框的正确性 需要在attB位点之前加上两个核苷酸 但不能是AA AG和GA 因为它们会和attB位点末端的胸腺嘧啶核苷酸T形成终止密码子。 得到PCR产物并电泳检测PCR程序设置和电泳方法同上 需要指出的是 若PCR的模板是包含卡那抗性基因 kanamycin resistance gene 的质粒 需要在电泳检测和纯化PCR产物前对其进行消化 使用的酶是Dpn 作用是为了去除模板对后续反应的干扰。 消化的体系和过程 在50μl的PCR反应体系中 加入5 μl10X REact Dpn37 孵育15 min 65 热激15 min使Dpn BP反应得到entryclone 反应体系如下 BP反应的引物组分Table BPreaction Components Sample Negative control positive control attB PCR product 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW control plasmid 100 ng TEBuffer pH 其中携带attB位点的PCR产物的量可以用以下公式来计算 50 fmoles 2500 bp 660 fg fmoles ng106fg 82 PCRproduct required 实验步骤如下 按上面计算方法和反应体系加入合适体积的pDONRTMvector 和PCR产物 20冰箱里拿出BP Clonase II enzyme mix 放在冰盒上两分钟左右使其解冻。 轻轻涡旋BP酶两次每次两秒钟 BPClonaseII enzyme mix 并立即将其送回 20 冰箱里 样品轻轻涡旋几次使其混合均匀。 25孵育1 蛋白酶K37 孵育10 min。 之后进入转化环节后续实验流程同经典载体构建 最终得到含有attL位点的entry clone。 LR反应组分Table LRreaction Component Sample Negative Control attL4 attR1entry clone 10 fmoles attL2entry clone 10 fmoles attR2 attL3entry clone 10 fmoles pDEST R4 R3 Vector II 20 fmoles TEBuffer pH 使用Infusion方法快速大量构建载体的方法 fusion是一种不依赖于限制性内切酶Restriction Free 的克隆方法 引入此方法的最初动机是为了在一个载体的任意位置引入外源DNA片段。此方法基于DNA片度的扩增 得到的大量的DNA可以作为线性载体扩增的模板。这个方法可实现将多个不同的外源基因同时插入某一个特定的载体的任意我们感兴趣的位置 从而弥补了位点特异性重组系统中对特异位点和特殊系统的需求 为分子克隆和蛋白表达的调控提供广阔的思路和方法。这种方法的原理是DNA片段之间的同源重组 现在应用比较广泛的是由Clontech公司提供的In FusionTM system它可以实现以下克隆需求 同时克隆多个DNA片段 Simultaneous cloning 基因的替换 Gene replacement 多位点突变 Multisite mutagenesis 多组分重组 Multi componentassembly 同时插入和删除基因 Simultaneous insertionand deletion 引物设计及目的基因片段扩增该方法的原理和步骤同前in fusion PCR 只是这个方法中PCR产物需用Dpn 将模板消化。载体线性化载体线性化的方法既可以用特异性酶切消化也可以通过常规PCR 使用PCR的方式使载体线性化消除了对特异性酶切位点的依赖和限制 同时彻底实现载体和片段之间的无缝连接 消除后续由于特殊碱基序列的加入对实验结果的影响 同时大华 35大节省了时间和成本投入。fusion“连接”反应将纯化的DNA片段和载体按照2 1的摩尔比混合入250 EP管中必要时可以加入In fusionTM enzyme 由Clontech提供 和相应buffer 是反应总体系为10 μl。之后共同转入感受态细胞 进入筛选环节。 感受态细胞的制备在线虫载体构建的整个过程中 最重要的实验材料是各种促进反应进行的酶和高转化效率的感受态细胞。不同的载体因其携带筛选基因或者特异表达的宿主的不同 需要诸如DH5α、TOP10等不同类型的感受态细胞 例如在Multisite gateway反应中 通常需要借助ccdB的筛选机制 这种情况下就不能使用携带有ccdA基因的菌株 如TOP10F’ 。所以 在不同方法的构建中 要严格选择感受态细胞类型。以下以实验室常用的感受态细胞DH5α为例 详述用氯化钙 CaCl2 法的制备过程。 用CaCl2法制备感受态细胞的原理是通过低渗的CaCl2溶液在低温 时处理快速生长的细菌从而得到感受态菌株细菌外形膨胀为球形 这样的形态结构有利于外源DNA分子形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物 这种复合物会粘附在细菌表面 如果热激 细胞对DNA的吸收将大大加强。 实验的关键是选取出于对数生长期的菌株 所有的操作必须尽可能保持在完全无污染无杂菌并且低温的条件下进行。实验材料及准备事项 100ml 胰化蛋白胨 CaCl2的制备称取22 CaCl2溶于200ml事先灭菌的水中 充分溶解后保存于4 冰箱中。 将浓度为100的甘油120 高温灭菌。 器材10 ml移液管 需灭菌玻璃大培养皿 内铺一张滤纸 需灭菌大、中、小枪头各一盒 需灭菌 50 ml离心管 mlEP管 用铁饭盒灭菌 100 ml SOB培养基需40个EP管 步骤如下 80冰箱里取出DH5α 常温使其冻融后通过接种环接种细菌与无抗培养皿中。将培养板放入3 将预先水浴锅灭菌的15ml离心管放在超净台中 紫外照射半个小时以上。从培养皿上挑取单个菌落 接种至离心管中 导入3 ml无抗培养基LB 37 摇床振荡过夜培养 转速为300 rpm 。次日取1 ml菌液接种至100 ml LB培养基中 以215 rpm的转速37 培养2 3小时。期间 要每隔半个小时测定一下600 nm的OD值。 停止培养将烧瓶置于冰上10 15分钟 同时将预先灭好菌的50 ml离心管也置于冰上冷却至0 在超净台中将菌液尽可能平均的分装入两个50 ml离心管中 以4000 rmp的转速离心10分钟。 弃上清将离心管倒置在滤纸上1分钟 以吸干残留的培养基。每个离心管中加入5 ml预冷的浓度为0 1M的CaCl2溶液 重悬菌体 并开始计时 可以用移液枪轻轻反复吹打30分钟。 将悬浮好的菌液再次以4000rmp的转速离心5分钟 去掉上清 吸干残余培养基后 每管加入2 ml预冷的浓度为0 M的CaCl2溶液反复吹打以重悬菌体 此时可以将两个离心管合为一个 放于冰上预冷20分钟 这期间 可以将已灭菌的1 mlEP管放于冰上预冷。 加入500 μl浓度为100 的甘油 mlEP管中。等全部分装完成时 投于液氮中1个小时 之后再转移到 80 冰箱中。 细菌转化效率的检测方法 设置阳性对照和阴性对照 阳性对照是为了估算细菌的转化效率 阴性对照是排除感受态细胞被污染的可能 及查明失败的可能因素。 阴性对照 只将感受态细胞涂于含某种抗性的平板上 而不加入任何DNA 正常情况下不应该有单菌落出现。 阳性对照 选择标准质粒 一般是pUC19 以50 pg、100 pg的量分别转化到感受态细胞里 将平板放于37 培养箱里过夜培养。数单菌落的个数以估计感受态的转化效率。 效率估算公式为 转化率 1000克隆 10pg DNA 当此值达到1 106时 可满足一般克隆的实验需求 当此值达到1 107时 可用作更复杂克隆的构建需求。 线虫的显微注射通过将外源基因显微注射到雌雄同体的线虫的性腺 gonad 能够获得有种系特异性的线虫。DNA片段可以通过染色体之间的同源和非同源的整合被传递到下一代中。显微注射的步骤如下 制作Pad将配置好的2 的琼脂糖放在水浴锅内防止其凝固。吸取100 μl于干净的载玻片上 并迅速将另一块载玻片轻压上面 待琼脂糖稍微干燥时取走载玻片 标记Pad的正反面之后放于干燥箱 80 中过夜。拉制电极常常用含有内芯的硼硅玻璃微电极作为注射用电极 该电极的外径为1 nm内径0 75 nm。用拉制仪拉制好的电极尖端是封闭的 在用之前需要打开一个开口 开口的大小要适宜。 准备注射液注射液的体系一般选取10 目的载体质粒的浓度范围为110 μl。其余体积用1TE补平。以12 000 rpm转速离心3分钟。 吸取1μl注射液到拉好的电极中 放置1520分钟 目的是为了使注射液通过内芯的虹吸作用流入电极尖端 并排除内气泡。 拿出注射要用的Pad在上面滴一滴油 保证有足够的油使线虫减慢干燥的过程 但不能太多以使其移动。 用一个干净的针needle 触碰到油上面 挑取N2时期的成虫 线虫挑取的区域应该远离菌斑所在位置 以避免将菌落带到pad上面。选择有容易辨别的gonad的线虫也同样重要。将线虫垂直放在pad上 使其gonad位于左侧 通常 线虫的阴部 vulva 会指向与needle的方向 两侧的gonad会直接与体壁对应。 当needle恰好位于载玻片上时将线虫聚焦在10 的物镜下 确定看到线虫的gonad。将线虫以和needle成15 到45 的角度摆放 通过轻轻降低needle使其和线虫出于同一水平。转换到40 物镜 聚焦到胞体的gonad 使用调试器上下移动needle 直到针尖对准胞体的gonad。 轻轻沿着needle移动线虫当needle插入线虫体内时 按照gonad和虫体壁处于相反位置的方式轻轻压线虫。轻旋调节器 knob 开始DNA注射液的流入 快速的开合 如果needle确定位于gonad处 此处部位会膨胀并充满液体。如果液体流动不畅 轻轻触碰桌面有助于解决此问题。要避免因加入液体过多导致液体沿着needle进入部位流散到线虫的其他部位。 将needle从线虫中拿出建议沿着逆时针方向。回到10 物镜下 滴一滴M9 buffer使线虫悬浮。使用眉毛挑将线虫放置于另外一个含有M9 buffer的板子上。这样做的目的是为了洗掉多余的油。再将线虫挑到含有细菌的板子上。一个板子上可以放置多条注射后的线虫。两三天后 数F1转基因线虫 并将折射成功的线虫单独转移到板子上以得到有稳定转基因种系的线虫。 显微注射线虫的gonadFig elegansgonad 3910 可能出现的问题及策略 注射后线虫破裂或者死掉的原因可能是needle太大了 或者线虫缺水死亡 方法可能是每注射一个线虫的gonad就换一个新的needle 如果线虫没有直立 原因可能是pad太薄或者需要没烘干 可以通过将板子放在罩子上几个小时来烘干 如果线虫干的太快 可以使用更薄的pad或者在注射前将线虫转移到较湿的板子上。 实验结果与讨论实验中用到的质粒的构建方法 在前言部分和方法部门已做了详细阐述 需要研究的相关基因的启动子的信息 诸如启动子大小 表达部位等 借助于相关文献的报道 在Wormbase中截取特定长度的DNA序列 在NCBI中查找此基因的上下游序列和基因方向 借助网页UCSC提供的序列信息最终得到启动子序列。但在设计启动子引物时 必须留意到序列中3’端和5’端的序列可以根据引物的匹配性在小范围内适当调整。还有一些神经元的位置因为缺乏确切表达谱的启动子而无法最终确定。线虫有302个神经元 标记这些神经元需要大量的质粒构建。在实验初期 我们通过传统酶切连接方法和改造的常用线虫载体组成的BP反应来实现。但随着课题的发展和方法的改进 我们发现Multisite gateway方法更为便捷和高效 特别是在购买了雌雄同体线虫启动子库后 这种技术不仅被用来标记线虫神经元 更多的用在rescue实验和钙信号的测定的构建中。同时 为了使整个课题有一套完整的体系 我们又花费大量的精力将之前不太标准的由gateway反应得到的构建进行了改造 得到一个可以通用的表达体系。 改造Multisitegateway 中的载体pDESTR4 R3为pPD49 26 R4 R3 在使用Multisite gateway 技术构建多克隆载体的过程中 我们发现 这个系统并不是完美的 因为这个系统中各个重组位点的序列有一定的相似性 所以如果想要插入载体的片段的序列 特别是与引物匹配的那一段 与重组位点有相似性时 可能会导致这个技术中所涵盖的反应失败。同时 当我们想用一个启动子驱动不止两个以上基因的表达时 不能直接只用Invitrogen公司提供的试剂盒中的pDESTR4R3 因为外源基因在线虫体内表达时 需要3’UTR稳定整个翻译过程中的顺利进行 但该公司试剂盒提供的载体中不含我们需要的3’UTR 因此 我们改造了一个新的LR反应的载体pPD49 26 R4R3 因为pPD49 26中含带unc54 3’UTR 而且实验证华 41明我们改造的载体同样有很高的反应效率 1在Multisitegateway反应中验证pPD49 26 R4 R3的有效性 Pgpa 4特异性标记ASI神经元 可以驱动TagRFP t在此神经元中表达。 为明场与荧光共定位的图。Fig pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI can 改造attL1Promoter attL2为attL4 promoter attR1 验证adaptor clone 如前所述 我们将携带attB1 attB2位点的启动子进行改造得到了标准Multisite gateway反应中的第一个entry clone 在这个改造的过程中 需要引入一个中间反应物 adaptor clone。如果我们可以观察到改造后的启动子能够驱动荧光蛋白在特定部位表达 由此可以验证adaptor clone的有效性。在本课题中 我们使用改造后的启动子Pdaf 7驱动荧光蛋白在神经元ASI里表达 由此adaptor clone的有效性得到验证。

掌握这些技术，基因克隆不是梦

在过去的几十年里,分子生物学家已经开发许多可以用来更快地构建目的DNA序列结构的技术来简化和规范克隆过程。 你熟悉这些克隆技术吗?下面我们来看看这些技术的特点。 1, 限制性酶切与连接法 长期以来，限制酶切与连接法被认为是一种传统的克隆方法。这个方法便宜灵活，可以分为两步过程：酶切和连接。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA片段上并切割双链DNA。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中，最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。这个方法原理较简单，我不做过多介绍。 2, Gateway 克隆技术 Gateway克隆发明于九十年代末，由walhout等提出，一种通用性的克隆方法，与传统克隆方法相比，Gateway技术的优点是可以不必考虑目的DNA 是否有合适的酶切位点，也不必进行繁琐而费时费力的酶切和连接反应，就可以按确定的方向和读码框快速而准确地将目的基因克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上。 它利用λ噬菌体与大肠杆菌染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切除反应，即LR和BP。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR 反应是一个attR入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或多个目的载体。重组位点attB、attP、attL和attR 由噬菌体λ和大肠杆菌编码的酶合剂特异识别。 Invitrogen公司开发了包括运用于原核、酵母、昆虫和哺乳动物等不同宿主的表达载体，大大提高了Gateway技术的适用性。Gateway技术已被广泛用于高通量载体的构建 3, Gibson Assembly 传统的限制性内切酶克隆技术，会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”，这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼，因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。Now我给大家介绍一下Gibson Assembly，一种无缝克隆方法。 Gibson组装最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段，当然也适合将目的DNA插入载体中。如下图所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通过PCR法加上）；然后，将这些DNA片段和一种master mix（含有三种酶）混合孵育一个小时就可以了。这种master mix含有三种不同类型的酶：1）一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。2）一种聚合酶，用于修补gap。3）一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。 这个系统最厉害的是，这三种酶都可以在同一个温度下很好的发挥功能，所以整个反应在50摄氏度条件下一个小时就可以完成。一小时后，样品可以直接用于转化。当然Gibson Assembly也有缺陷，这一过程并没有生成限制性酶切位点，因而不方便将拼接片段转移到另一个载体上。建议最好是事先设计好限制性位点。需要注意的是，如果一次性组装超过5个片段，成功率会大大降低。 4, Golden Gate 拼装法 Golden Gate 拼装法主要是依赖于一种II型限制性内切酶(ⅡS 型酶，如 BsaⅠ和 AarⅠ)，这种酶能够在其DNA 识别处的相邻位置进行剪切。如果人为设计识别位点不同的相邻序列，就可利用同种限制酶产生不同的粘性末端，从而一次组装多个片段，这克服了传统多片段组装时限制酶种类的限制。 具体到原理：一般的内切酶分为三种，通常用的是2类的酶，识别特定的回文序列，并从中切开。而golden gate一般用的是3类酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1这三种酶，识别特定的序列，并在特定序列以后隔几个任意的碱基切开，这样子就可以克服2类酶必须要回文序列才能用的缺点，实现片段的连接。 另外，要说的是连接部分，传统的连接酶是T4用的比较多，T4可以连接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特点是只能实现连接黏性末端。因为T7的这一特性，所以在连接的时候可以把片段跟切好的载体混到一种特殊的buffer里，在这里内切酶跟T7都可以保持比较高的活性，通过温度的调节，实现克隆的构建。因为用的是T7，所以不用担心PCR片段自连降低克隆效率，又因为是用的三类酶，可以通过黏性末端的设计，可以一种酶切多个片段，又不用担心这几个片段之间的乱连，来达到分子克隆的目的。 5, TOPO克隆(TA克隆) TOPO克隆使用DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有限制酶和连接酶的特性。这种酶在复制期间切割并重新连接DNA，整个克隆过程可以在室温下完成，且仅需5分钟。TOPO克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA 拓扑异构酶I。 pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3’末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3′ 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。 自沃森，克里克在1953年发现DNA双螺旋结构不过60余年，如今的DNA克隆技术却已发展到如此的程度。合成生物学正处在高速发展时期，这些进步技术的进步必将推动生物革命浪潮的到来。你都掌握了吗？ Reference 李华琴,林陈水,张文倩. 不依赖连接反应的高通量克隆方法. 氨基酸和生物资源.2013,35(4):43-46 . Methods in enzymology, 2000, 328: 575-IN7. Gibson, D.G., et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345. . Nucleic acids research, 2011, 39(13): 5790-5799. https://www.zhihu.com/question/49568914/answer/116646832

ip subnet 和ip address及gateway和mask他们分别代表什么之间有什么联系和区别

ip subnet是IP子网ip address是ip地址gateway是网关mask是子网掩码建议多看点网络的基础书籍。一个IP地址(ip address)是32位二进制数组成，例如203.202.100.132，这种是点分十进制的方式，用二进制表示为01001000.00000000.00000000.00000000，通过IP地址可以在一个网络上唯一标识一个主机。而IP地址通过规定分为ABCDE五类，每个类的地址段所包含的IP地址数量又不同，为了区分出不同类的IP地址，需要通过子网掩码(mask)来确定该地址属于哪个类，子网掩码也同样是由32位的二进制数组成，由0和1组成，和IP地址结合使用，有IP地址就一定有子网掩码，子网掩码确定了哪些IP地址是属于同一个段哪些不是。例如，8位的子网掩码按照二进制表示为11111111.00000000.00000000.00000000，这里涉及到一个逻辑与运算的过程，1的部分表示需要比较，0的部分表示不需要比较，即两个不同的IP地址在前8位如果一样，则两个IP地址属于同一个段，反之则不属于同一个段。之所以将IP地址分类，是因为在早期的IP网络里面每个机构或组织对IP地址的需求量不一样，例如假如我的网络里只有200个主机，那么我用一个C类的地址就可以了，这样可以尽可能的利用IP地址不造成浪费，也可以形成一定的规范性。当网络发展到一定的程度的时候，发现光靠ABCDE五类地址来区分IP地址已经不能达到网络日益细化的目的，例如我一个网络只有10台主机，但是按照最初的网络协议，只能分配一个具有256个地址的C类地址给我，那么造成极大的浪费，于是就推出了子网的概念(ip subnet)，将一个ABC类地址分配以更加长的子网掩码来将这个地址段进一步划分，从而可以将一个固定的地址段分成若干个子地址段，可以分配给更多的人，这种技术称之为可变长子网掩码(VLSM)。gateway是一个IP地址，这个IP地址比较特殊，若我这个地址段内的地址需要和别的地址段的地址通讯，那么必须由网关将数据转发给别的地址，而这个地址段内的地址都不直接和其他段的地址联系，而是通过网关与其他段的地址联系。就好比一个水闸，左边是河水右边是海水，要把海水注入到河水中，则需要水闸来实现。

rna水平修饰对基因表达影响

园艺植物分子生物学少于1000人选课更新日期：2022/12/14开课平台爱课程（中国大学MOOC）开课高校西北农林科技大学开课教师管清美、徐记迪、龚小庆、战祥强、刘曼、胡体旭学科专业农学 草学类开课时间2022/03/28 - 2022/07/29课程周期18 周开课状态已结课每周学时-现在去学习课程简介查看更多从20世纪40年代开始，无数生命科学家用他们的智慧和汗水，揭开了生物遗传的谜底，也就是基因是遗传物质的携带者。因此，以研究DNA-RNA-蛋白质为主的分子生物学成为揭示生命奥秘最关键的金钥匙。分子水平的研究，正在越来越多地影响各个传统生物学科和农林学科，包括园艺学。《园艺植物分子生物学》这门课程将为您提供有关现代分子生物学各分支的基本理论、主要实验依据，介绍最近20~30年来现代分子生物学高速发展的新理论、新技术、新方法，并在讲述分子生物学理论知识的基础上，结合园艺学科的特色，阐述分子生物学在园艺作物领域的研究进展与应用。课程分为绪论、染色体与DNA、生物信息的传递、分子生物学研究法、原核基因表达调控、真核基因表达调控、基因组与比较基因组等9个章节。（课件中的图片来源于书本及网上，仅做教学用）。课程大纲查看更多绪论1.1引言1.1.1创世说与进化论1.1.2细胞学说1.1.3经典生物化学和遗传学1.1.4DNA的发现与基因学说的建立1.2分子生物学简史t1.2.1蛋白质化学方面；t1.2.2分子生物学研究历程中的重大事件t1.2.3其他对分子生物学的发展起重大作用的事件1.3分子生物学的主要研究内容t1.3.1重组DNA技术（基因工程）；t1.3.2基因表达调控研究；t1.3.3生物大分子的结构功能研究（结构分子生物学）t1.3.4基因组、功能基因组与生物信息学研究；1.4展望染色体与DNA2.1染色体t2.1.1染色体概述t2.1.2真核细胞染色体的组成2.1.3原核生物基因组2.2DNA的结构t2.2.1DNA的一级结构t2.2.2DNA的二级结构t2.2.3DNA的高级结构2.3DNA的复制t2.3.1DNA的半保留复制t2.3.2DNA复制的一些基本概念2.4原核生物和真核生物DNA复制的特点2.4.1DNA复制的基本特点2.4.2真核生物DNA复制起始调控2.4.3线性DNA末端复制2.5DNA的突变与修复t2.5.1DNA的突变t2.5.2DNA损伤的修复机制2.6DNA的转座t2.6.1转座子的分类和结构特征t2.6.2真核生物钟的转座子t2.6.3转座作用的遗传学效应生物信息的传递（上）——从DNA到RNA3.1RNA的结构、分类和功能3.1.1RNA的结构特点；3.1.2RNA在细胞中的分布；mRNA、tRNA、rRNA3.1.3RNA的功能；3.2RNA的转录概述3.2.1RNA转录与DNA复制的比较3.2.2转录机器的主要成分——RNA聚合酶3.2.3t启动子与转录起始；3.3.RNA转录的基本过程3.3.1模板识别3.3.2转录起始3.3.3转录延伸3.3.4转录终止；3.4原核与真核生物的转录及产物特征比较3.4.1原核与真核生物转录过程比较；3.4.2原核生物mRNA的特征3.4.3真核生物mRNA的特征3.5原核生物RNA聚合酶及其转录3.5.1原核生物RNA聚合酶3.5.2原核生物启动子结构3.5.3原核生物启动子中-10区与-35区的最佳距离3.5.4原核生物RNA聚合酶对启动子的识别和结合-氢键互补3.5.5原核生物RNA转录周期（1）RNA转录起始；（2）新生RNA链的延伸（3）延伸RNA聚合酶同时具有合成和校对两种功能；（4）RNA转录的终止；——终止子和ρ因子；抗终止；3.6.真核生物RNA聚合酶与RNA转录3.6.1真核生物聚合酶——种类，组成分析、结构3.6.2真核生物启动子对转录的影响3.6.3转录起始复合物的组装3.6.4增强子及其功能3.7RNA转录的抑制3.7.1嘌呤和嘧啶类似物3.7.2DNA模板功能抑制剂3.7.3RNA聚合酶抑制剂3.8真核生物RNA的转录后加工3.9RNA、再编码和化学修饰3.10mRNA转运3.11核酶3.12RNA在生物进化中的地位生物信息的传递（下）——从mRNA到蛋白质4.1遗传密码——三联子4.2tRNA4.3核糖体4.4蛋白质合成的生物学机制4.4.1氨基酸的活化4.4.2翻译的起始4.4.3肽链的延伸4.4.4肽链的终止4.4.5多核糖体与蛋白质合成4.4.6蛋白质前体的加工4.4.7蛋白质的折叠4.4.8蛋白质合成的抑制剂4.5蛋白质运转机制4.6蛋白质的修饰、降解与稳定性研究分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术5.1重组DNA技术史话5.2DNA基本操作技术5.2.1基因组DNA提取5.2.2核酸凝胶电泳5.2.3聚合酶链式反应技术5.2.4重组载体构建5.2.5实时定量PCR5.2.6基因组DNA文库的构建5.3RNA基本操作技术5.3.1总RNA提取5.3.2mRNA的纯化5.3.3cDNA的合成5.3.4cDNA文库的构建5.3.5基因文库的筛选5.3.6非编码RNA研究5.4基因克隆技术5.4.1RACE技术5.4.2RAMPAGE技术5.4.3Gateway大规模克隆技术5.4.4基因的图位克隆法5.4.5热不对称交错多聚酶链式反应克隆T-DNA插入位点侧翼序列5.5蛋白质与蛋白质组学技术5.5.1双向电泳技术5.5.2荧光差异显示双向电泳技术5.5.3蛋白质质谱分析技术分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.1.1转录组测序分析和RNA-Seq6.1.2RNA的选择性剪接研究6.1.3原位杂交技术6.1.4基因定点突变技术6.2基因敲除技术6.2.1基本原理6.2.2高等动物基因敲除技术6.2.3植物基因敲除技术6.2.4基因组技术6.3蛋白质及RNA互作技术6.3.1酵母单杂交系统6.3.2酵母双杂交系统6.3.3蛋白质相互作用技术6.3.4染色质免疫共沉淀技术6.3.5RNAi技术及其应用6.4在酵母细胞中鉴定靶基因功能6.4.1酵母基因转化与性状互补6.4.2外源基因在酵母中的功能鉴定6.5其他分子生物学技术6.5.1凝胶滞缓实验6.5.2噬菌体展示技术6.5.3蛋白质磷酸化分析技术6.5.4蛋白质免疫印迹实验6.5.5细胞定位及染色体技术6.5.6全基因组关联分析及应用原核基因表达调控7.1原核基因表达调控总论7.1.1原核基因表达调控分类7.1.2原核基因表达调控的主要特点7.2乳糖操纵子与负调控的主要特点7.2.1酶的诱导——lac体系受调控的证据7.2.2操纵子模型及其影响因子7.2.3lac操纵子DNA的调控区域—P、O区7.2.4lac操纵子中的其它问题7.3色氨酸操纵子与负阻遏系统7.3.1trp操纵子的阻遏系统7.3.2trp操纵子的弱化作用7.3.3trp操纵子的其他调控机制7.4其他操纵子7.4.1半乳糖操纵子7.4.2阿拉伯糖操纵子7.4.3阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答7.4.4二组分调控系统和信号转导7.4.5多启动子调控的操纵子7.5固氮基因调控7.5.1固氮酶7.5.2与固氮有关的基因及其表达调控7.5.3根瘤的产生以及根瘤相关基因的调控7.6转录水平上的其他调控方式7.6.1σ因子的调节作用7.6.2组蛋白类似蛋白的调节作用7.6.3转录调控因子的作用7.6.4抗终止因子的调节作用7.7转录后调控7.7.1mRNA自身结构元件对翻译的调控7.7.2mRNA稳定性对转录水平的影响7.7.3调节蛋白的调控作用7.7.4小RNA的调节作用7.7.5稀有密码子对翻译的影响7.7.6重叠基因对翻译的影响7.7.7翻译的阻遏7.7.8魔斑核苷酸水平对翻译的影响真核基因表达调控8.1真核基因表达调控相关概念和一般规律8.1.1真核基因表达的基本概念8.1.2真核基因表达的方式和特点8.1.3真核基因表达调控一般规律8.2真核基因表达的转录水平调控8.2.1真核基因的一般结构特征8.2.2增强子及其对转录的影响8.2.3反式作用因子8.3真核基因表达的染色质修饰和表观遗传调控8.3.1真核生物DNA水平上的基因表达调控8.3.2DNA甲基化与基因活性调控8.3.3组蛋白修饰对真核基因表达的影响8.3.4RNA水平修饰对基因表达的影响8.4非编码RNA对真核基因表达的调控8.4.1干扰小RNA8.4.2miRNA8.4.3长链非编码RNA8.5真核基因其他水平上的表达调控8.5.1蛋白质磷酸化对基因转录的调控8.5.2蛋白质乙酰化对转录活性影响8.5.3激素对基因表达影响基因组与比较基因组学11.1高通量DNA序列分析技术11.1.1SangerDNA序列测定基本原理11.1.2基因组DNA大片段文库的构建11.1.3鸟枪法序列测定技术及其改良11.1.4新一代测序技术11.2新测序平台的应用11.2.1单核苷酸多态性（SNP）研究11.2.2高通量测序在染色体构象俘获技术上的应用11.2.3核糖体图谱测序和多核糖体图谱测序园艺植物分子生物学进展12.1前言——重新审视“园艺学”和“分子生物学”的交叉12.1.1不断发展的“园艺”产业一、现代化园艺学是一门传统学科，园艺产业是一个古老的产业，随着人类社会的发展、科学进步和技术创新使园艺科学和园艺产业不断发展。传统学科和古老产业进入了现代化进程。二、多元化传统园艺产业的主要功能是生产，是为消费者提供园艺产品。因此，传统园艺产业的功能是单一的，以物质生产为主要功能。随着人类社会的发展，园艺产业的功能也在不断拓展，呈现出多元化的趋势。要以产业现代化与多元化主要内容：1、现代高新技术在园艺产业中的应用。2、园艺产品及生产过程的标准化和园艺生产经营的产业化。3、可持续发展的理念和技术在园艺产业中的应用。4、拓展园艺产业功能，实现城乡一体化的都市园艺与观光园艺。5、使园艺产业走向家庭的园艺文化与园艺疗法。三、园艺产业可持续发展当人类社会更加关注环境与可持续发展是当生态环保与生存安全日益被人类所重视。园艺产业可持续发展的理念也越来越深入人心，可持续发展技术的应用也越来越普遍。园艺产业可持续发展就是只要发展生态园艺、无公害园艺和有机园艺。12.1.2不断发展的“分子生物学”回顾前边讲述内容（基础知识）注：可以模仿翻转课堂的形式，采取学生问答方式检测前期教学效果，提高学生学习积极性，并针对学生对分子生物学基础知识掌握的情况开展教学。染色体与DNA生物信息的传递：中心法则中心法则，一直在发展和完善，未知的还有很多园艺植物分子生物学研究技术基因表达调控植物基因组学园艺植物花和果实发育的分子生物学园艺植物逆境分子生物学12.2分子生物学在园艺植物研究中的应用注：课时有限，只介绍以下部分内容12.2.1分子育种一、分子标记二、群体（数量）遗传学三、基因组学12.2.2基因工程-转基因主要有异源表达（启动子：自身、条件诱导型或组成型）、RNAi（敲低）、多基因共转一、抗病二、抗虫三、抗非生物胁迫四、风味品质提升12.2.3基因组定点及其拓展一、ZFn、TALEN、CRISPR二、Cas、primingeditor三、染色体片段替换（敲入）12.2.4比较基因组学和泛基因组学12.2.5多组学联合技术12.3展望园艺植物研究的发展，未来不可限量2022 国家高等教育智慧教育平台 版权所有京ICP备12020869号-28京公网安备 11010202007783号联系我们关于网站帮助中心隐私政策知识产权声明网站运维：高等教育出版社

ligation-independent cloning

不使用连接酶克隆 不需要连接的克隆方式： Ligation-Independent cloning ，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。 一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与pa http://cache.baidu.com/c?m=9f65cb4a8c8507ed4fece763104687270e54f733678a8d4968d4e419ce3b46111727fee867734a5f97923c7a47f41f4bea863679300622bd8cc8ff109be4cc3c6ad567627f42dd14419542f2975124b137902cfeae69bce6a665d1f98e85880815dd53742bdeadd7015c41&p=8b2a930dcadd06f90fbd9b780e54&user=baidu

网络对克硬盘怎么克

一、分区备份　　使用Ghost进行系统备份，有整个硬盘（Disk）和分区硬盘（Partition）两种方式。在菜单中点击 Local（本地）项，在右面弹出的菜单中有3个子项，其中 Disk表示备份整个硬盘（即克隆）、Partition 表示备份硬盘的单个分区、Check 表示检查硬盘或备份的文件，查看是否可能因分区、硬盘被破坏等造成备份或还原失败。分区备份作为个人用户来保存系统数据，特别是在恢复和复制系统分区时具有实用价值。　　选 Local→Partition→To Image 菜单，弹出硬盘选择窗口，开始分区备份操作。点击该窗口中白色的硬盘信息条，选择硬盘，进入窗口，选择要操作的分区（若没有鼠标，可用键盘进行操作：TAB键进行切换，回车键进行确认，方向键进行选择）。 在弹出的窗口中选择备份储存的目录路径并输入备份文件名称，注意备份文件的名称带有 GHO 的后缀名。 接下来，程序会询问是否压缩备份数据，并给出3个选择：No 表示不压缩，Fast表示压缩比例小而执行备份速度较快，High 就是压缩比例高但执行备份速度相当慢。最后选择 Yes 按钮即开始进行分区硬盘的备份。Ghost 备份的速度相当快，不用久等就可以完成，备份的文件以 GHO 后缀名储存在设定的目录中。二、硬盘克隆与备份　　硬盘的克隆就是对整个硬盘的备份和还原。选择菜单Local→Disk→To Disk，在弹出的窗口中选择源硬盘（第一个硬盘），然后选择要复制到的目标硬盘（第二个硬盘）。注意，可以设置目标硬盘各个分区的大小，Ghost 可以自动对目标硬盘按设定的分区数值进行分区和格式化。选择 Yes 开始执行。　　Ghost 能将目标硬盘复制得与源硬盘几乎完全一样，并实现分区、格式化、复制系统和文件一步完成。只是要注意目标硬盘不能太小，必须能将源硬盘的数据内容装下。 　　Ghost 还提供了一项硬盘备份功能，就是将整个硬盘的数据备份成一个文件保存在硬盘上（菜单 Local→Disk→To Image），然后就可以随时还原到其他硬盘或源硬盘上，这对安装多个系统很方便。使用方法与分区备份相似。三、备份还原　　如果硬盘中备份的分区数据受到损坏，用一般数据修复方法不能修复，以及系统被破坏后不能启动，都可以用备份的数据进行完全的复原而无须重新安装程序或系统。当然，也可以将备份还原到另一个硬盘上。 　　要恢复备份的分区，就在界面中选择菜单Local→Partition→From Image，在弹出窗口中选择还原的备份文件，再选择还原的硬盘和分区，点击 Yes 按钮即可。 四、局域网操作 LPT 是通过并口传送备份文件,下面有两个选项：slave 和 master, 分别用以连接主机和客户机。 网络基本输入输出系统 NetBios 和 LPT 相似, 也有 slave 和 master 两个选项, 作用与 LPT 相同。 先和平时一样将要 ghost 的分区做成一个 *.gho 文件，再在一台 win98 上安装Symantec Ghost 企业版，重启。 1. 首先制作一张 ghost 带网卡驱动的启动盘。Start 》 Programs 》 Symantec Ghost 》 Ghost Boot Wizard－》Network Boot Disk 如果你的网卡在列表内直接选择它就可以生成一张带 PC-DOS 的启动盘。（但 6.5版的生成的软盘经常有问题，不能成功启动）如果你的网卡不在列表内，你要建立专用的 Packet Driver。ADD-》Packet Driver (网卡的驱动程序中有)往下根据提示一步一步走，填入工作站的 ip（ghost 一定要 tcp/ip 协议）。最后生成一张软盘，但此软盘仍不能使用，要改 autoexec.bat 文件在 net xxxx.dos 后面加一个16进制的地址，如 0X75 等。多台计算机只需改 wattcp.cfg 文件中的 ip 即可: IP = 192.168.100.44 NETMASK = 255.255.255.0 GATEWAY = 192.168.100.1 2. 在 server 端运行 multicast server 出来的画面。先给 server一个Session Name（别名）如：bb，再选择 image file 就是你的 gho 文件。然后 －》Dump From Client-》rtitions-》More Options-》 在 auto start 的 client 中填入 50（如果你要同时复制50台）-》accept client 就算完成了，当你的工作站数达到50台时，server就自动传送*.gho 文件。 3.详述： 目前，相当多的电子教室都采用了没有软驱、光驱的工作站。在没有软驱、光驱的情况下，当硬盘的软件系统出现问题时，能否实现网络硬盘克隆呢？PXE（Preboot Execution Environment，它是基于 TCP/IP、DHCP、TFTP 等 Internet 协议之上的扩展网络协议）技术提供的从网络启动的功能，让我们找到了解决之道。下面，我们就来讲解怎样采用Ghost 7.0来实现基于 PXE 的网络硬盘克隆。　　网络硬盘克隆过程简述　　网络硬盘克隆过程为：在装有软驱的工作站上，用一张引导盘来启动机器，连接到服务器，使用 Ghost 多播服务（Multicast Server）将硬盘或分区的映像克隆到工作站，这样就实现了不拆机、安全、快速的网络硬盘克隆。

如何使用网络ghost的原理和运用

一、将一台客户机装好系统及所有应用程序及游戏后，用GHOST.EXE制作一个全盘影像，例：win98.gho二、制作全盘影像时要注意2点：1、因制作全盘影像时，不能将影像文件保存在本盘上，所以要记得挂多一个硬盘用来存放影像文件；2、因一般40G的硬盘，在装了系统及游戏后，大都已使用30多G的空间，制作出来的全盘影像会达14-17G左右，并在制作过程中，影像文件达到2-4G时（时间太紧，没研究为什么会有时2G有时4G）会弹出一个提示窗，并有OK、取消、文件名三个按钮，选OK的话，GHOST自动生成一下个后继文件，文件名后缀好象是gls；选“文件名”的话，GHOST会让你自己输入后继文件名及存放位置。（后继文件的意思就象制作WINRAR分卷压缩时的*.r00、*.r01这种文件。呵，我不太会表达，大家明白就好。）三、以我用40G硬盘36G数据制作全盘影像为例，生成了四个4G左右的影像文件，文件名是：win98.gho、win98.gls、win982.gls、win983.gls（注：那天做盘时太忙，只记得后缀文件好象是gls这个后缀名，又好象是gsl，反正大家制作时以眼见为实吧。呵，不然我就误人子弟了。）四、运行GhostCast网络克隆服务端文件GhostSrv.exe注：1、“影像文件”处只要选中后缀为gho的文件就行了，后继文件不用管。2、要进行全盘网络克隆时选中“硬盘”，要进行分区网络克隆时（如：只是网络克隆C盘）选中“分区”，再点右边的下拉菜单，并选中要网络克隆的分区就行了。3、如果在自动开始模式里输入了条件，点击了“接受客户端连接”按钮后，实际上不能达到条件时（如：客户端数量处输了60，但实际上只有55台机接入），可以点击“发送”按钮开始网络克隆。4、如果未在自动开始模式里输入条件，点击“接受客户端连接”按钮后，确认所有客户端连接成功后，点击“发送”按钮开始网络克隆。五、服务器端点击“接受客户端连接”按钮后，就可以到客户机上运行客户端了。六、客户端上的准备工作：GhostCast网络克隆客户端设置（以原客户机已装系统，8139网卡，无软驱为例）：1、先COPY GhostCast网络克隆客户端文件：netghost.bat //加载网卡驱动及运行GHOST.exe的批处理8139.com //8139网卡驱动 FOR DOSWattcp.cfg //GhostCast网络克隆客户端配置文件ghost.exe //不用说明了吧到客户机上，并用记事本或DOS下的edit修改wattcp.cfg，内容如下：IP=192.168.0.108 //客户机IP，按实际修改NETMASK=255.255.255.0 //子网掩码GATEWAY=192.168.0.101 //GhostCast网络克隆服务端IP，按实际修改2、重启计算机，启动时按F8，并选第6项进入纯DOS。七、开始客户端的接入：运行netghost.bat，出现GHOST程序界面，选菜单上GhostCast - Multicast项按了OK了，如接入成功，就马上可以看到象单机克隆那样的界面了，这文章是在家里的单机上写的，没法抓图给大家看了，反正如果是进行全盘克隆，接入成功后，选OK，OK，YES。这样客户端就进入等待接收状态了。所有的客户端都接入成功并进入接收状态后，如果服务端那里设了自动开始模式条件，条件符合后就自动发送了，如果没有设置自动开始条件，我们就走回服务端机器那里，点击“发送”按钮，就开始网络克隆了。我们就可以坐下来，喝喝茶，抽抽烟，等待网络克隆完成了。给些数据大家参考：8G硬盘7.2G数据，制成的全盘影像文件为3.5G左右客户端25台：C433 128M 5400转HD 8139的10-100M自适应网卡服务器端：P3 800 256M 7200转HD 3COM的10-100M自适应网卡 XP系统1对25同时网络克隆耗时25分18秒40G硬盘36G数据，制成的全盘影像文件为16G多些客户端15台：CII800 128M 5400转HD 8139的10-100M自适应网卡服务端器：同上1对15同时网络克隆粍时1小时26分。